中米展酵菌究进食品酸研

1 引言

米酵菌酸是食品酸研椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的毒素，具有强烈的中米展毒性。该菌产生的酵菌究进外毒素米酵菌酸对人体的肝、肾、食品酸研心、中米展脑等重要器官均能产生严重的酵菌究进损害，是食品酸研引起人们严重食物中毒和死亡的主要原因。目前对米酵菌酸尚无特效解毒药物，中米展人们一旦中毒，酵菌究进病死率高达40%～100%。食品酸研发酵玉米面制品、中米展变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品是酵菌究进引起中毒的主要原因，常见的食品酸研食品有糯米面汤圆、吊浆粑、中米展小米或高粱米面制品、酵菌究进马铃薯粉条、甘薯淀粉等。

今年10月5日，黑龙江鸡西“酸汤子”事件，九人中毒全部死亡引发关注，“罪魁祸首”就是米酵菌酸。近几年来，我国由米酵菌酸引起的食物中毒事件时有发生。2018年7月，浙江省金华市某村民一家三人食用了含有米酵茵酸的变质黑木耳，引起食物中毒，最终一人死亡。2014年6月，云南省文山州广南县村民食用含有米酵茵酸的吊浆粑加工汤圆，死亡6人。随着食品品种、制作的多样性，对于米酵菌酸的检测能力以及适应市场快节奏的快速检测能力的需求与日俱增，本文就米酵菌酸在检测技术方面的研究现状以及后期方向进行综述，希望为后续研究提供参考。

2 米酵菌酸的前处理和检测方法

2.1 米酵菌酸的提取净化

米酵菌酸的提取主要是利用各种有机溶剂对样品的目标物质进行萃取。溶剂的选择主要取决于米酵菌酸的化学特性，米酵菌酸含有三个羧基为弱酸性有机化合物，因此采用的有机溶剂一般为甲醇、乙酸、乙腈等有机溶液及碱性溶液，同时也要考虑样品杂质及基质对提取以及后续检测步骤的影响。在使用质谱为检测手段的实验中，由于米酵菌酸容易电离出H+离子，因此多采用ESI负离子模式，在电离中基质虽然不会影响到标物的分离度，但是在其离子化过程中会产生基质效应，从而影响标物的峰型、定性及定量。所以在提取净化中，针对不同样品，采用溶剂、柱体、实验步骤都需要反复调试。目前国内的较为主流的前处理方法有固相萃取法、Qu ECh ERS法。

2.1.1 固相萃取法

目前固相萃取法在米酵菌酸中的应用已经相当成熟，通常是超声波震荡提取，利用SPE固相小柱进行净化。国内的此类方法大同小异，针对样品的不同，主要区别在于提取溶剂的搭配、用量、SPE的选择。

国标法GB5009.189-2016前处理中采用180 m L的甲醇-氨水溶液，还需静置1 h、超声波震荡30分钟、水浴、氮吹。该方法处理过程耗时时间长、步骤繁琐且耗费大量有机溶剂，已经被逐渐被淘汰。

针对银耳样品，周鹏等研究中以10 m L甲醇为提取剂，主要提取手段为多次超声波震荡，考察使用混合强阴离子交换柱净化提取液，1%氨水及氨水甲醇交替淋洗。此前处理方法步骤少、有机溶剂大量减少，对仪器及溶剂的要求都极低。

基于液质联用手段，覃冬杰等检测柳州螺狮粉中的米酵菌酸，研究表明样品量10 g、甲醇浓度75%、超声时间20 min、甲醇量50 m L为最优提取条件，以MAX固相萃取柱为净化条件，水与甲醇交替淋洗。

基于液质联用手段，曾雪芳等检测米粉及河粉中的米酵菌酸，其采用15 m L甲醇氨水溶液提取样品，超声波震荡，使用混合型阴离子交换柱净化提取液，水与甲醇交替淋洗。

基于液质联用手段，王俊虎等检测六神曲中的米酵菌酸，其采用10 m L甲醇为提取液，使用Oasis Max强阴离子交换柱净化样品，水与甲醇交替淋洗。

可见不管是国标法还是后续的改良方法，针对不同的样品、不同的基质，反相固相萃取法提取米酵菌酸有一定的规律。即采用一定浓度的甲醇溶液提取，超声波震荡，使用混合型阴离子交换柱净化提取液，后续的研究均证明此种前处理方式均能满足米酵菌酸定性定量的要求。

2.1.2 Qu ECh ERS法

Qu ECh ERS包括提取和净化2个部分，提取溶剂采用乙腈，净化采用分散固相萃取(dispersed solid phase extraction,d-SPE)，此方法与反相固相法差别比较大，由于具有快速、简单、经济、高效、耐用、安全的诸多优点，广泛应用于不同基质中农药多残留检测的样品前处理。目前此法在米酵菌酸的应用，在国内仅有一篇论著。梁明，胡均鹏等采用乙腈-水为溶剂，d SPE EMR-Lipid吸附剂，处理样品，研究表明当乙腈体积分数为80%时，提取效果最好，但其实验步骤比上述的固相萃取法稍显复杂。此方法提取速度快、溶剂使用量少、污染小、价格低廉、操作简便，无需良好训练和较高技能便可很好地完成，文中样品为河粉，此方法在酵米面制品中米酵菌酸的检测具有较高价值的探索性。

以上两种方法的区别见表2。

2.1.3 生物样本的提取

生物样本与食品样本材质上具有很大的不同，因此提取方法跟上述的方法有不小的区别。

基于液质联用的检测方法，徐小民等提取血浆中的米酵菌酸，采用乙腈为提取剂，混合型强阴离子交换柱萃取，水与甲醇交替淋洗。

基于液质联用的检测方法，张秀尧等提取尿液中的米酵菌酸，以3%高氯酸和正己烷为提取剂，历经漩涡、离心、氮吹得待测液。

2.2 米酵菌酸的检测方法

近年来针对米酵菌酸的检测报告比较少见，因此米酵菌酸的检测方法也比较缺乏。现在主流的检测手段有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱、荧光层析法。

2.2.1 高效液相色谱法(HPLC)

针对米酵菌酸化学特性，分子易保留于酸性环境，因此在色谱行为上，采用反相固相法，酸性流动相，使其保留增强，出峰时间推迟，峰形对称性更好。

食品安全国家标准GB5009.189-2016[6]中色谱条件采用反相固相法，水用冰乙酸调p H至2.5，进样量为20μL。苏永恒及侯佰立的高效液相色谱测定米酵菌酸均采用了此色谱条件，值得一提的是，侯佰立实验中对流动相进行测试，发现在流动相比例为78︰22，峰形对称尖锐。此检测方法进样量大，导致基质效应明显，易受样品基质干扰致使定性定量出现偏差。基于高效液相色谱，李红艳等研究极管阵列检测器结合固相萃取法快速测定食品中米酵菌酸残留，紫外检测器根据保留时间定性，检测结果可能存在假阳性，极管阵列检测器，通过保留时间和光谱扫描定性实现样品定性，比以往的高效液相方法精确简单，而又比液质法廉价，易于普及。液相色谱法有其自身的局限性，当样品中标物浓度较低时，经常检测不出来。

2.2.2 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)

高效液相色谱法受基质干扰较大，液质联用法样品前处理简单、进样量小、大大减少试剂消耗量、灵敏度高、且兼分离、定性(分子结构信息)、定量为一体，缩短了分析时间，是现在科学研究中主要的检测手段。液质法检测米酵菌酸，色谱中大部分采用酸性流动相，比如0.1%甲酸溶液-乙腈、乙腈-0.1%甲酸的10 mmol/L梯度洗脱，配合反相固相法进行分离。质谱中，均为电喷雾离子源(ESI)、负离子模式、多反应监测(MRM)；在二级质谱中，针对米酵菌酸的结构特性及官能团电离稳定性，大多数研究者选定m/z 441.3、m/z 397.2、m/z 485.1为定性离子或定量离子。值得关注的是，周鹏等[7]在对米酵菌酸的研究表明样品进样量在5u L以内时，进样量与目标物响应值呈线性关系，再次增加进样量，对目标物响应值的提高量越来越少，因此选择2 u L进样量，值得参考。曾雪芳等采用UPLC-MS/MS测定米粉和河粉中的米酵菌酸，色谱条件为使用混合型阴离子交换柱，以0.1%甲酸为流动相，其研究结果表明在酸性流动相中。米酵菌酸色谱峰峰型更好，质谱响应更强。

2.2.3 免疫层析快速检测法(ICA)

免疫层析法的原理是将抗原或抗体包被于固相载体硝酸纤维膜上，检测时将样品加到试纸上的样品垫，样品在毛细管作用下前移与标记探针相互作用形成复合物，可通过肉眼或对借助信号采集仪器对显色结果进行定性或定量分析。

张小波等人使用荧光层析法开发了米酵菌酸荧光定量检测卡。其原理是以米酵菌酸-牛血清白蛋白偶联物作为检测卡的包被原料，放置于硝酸纤维素膜上，然后将上海优晶生物科技有限公司自制的BA单克隆抗体与时间分辨微球标记放入微孔中，包被后的膜和标记后的微孔组装成快速检测卡。该检测卡的有效检测范围为1～100 ng/m L，可实现米酵菌酸现场快速定性定量检测。但该方法制备检测卡步骤复杂、成本高，市场需求不足以支撑，现在还没有量产。

3 总结和展望

米酵菌酸耐热性极强，任你煎、炸、煮、炖都不能破坏它的毒性，而其致死率极高，因此在生产环节、销售环节的检测显得尤为重要。目前国内米酵菌酸的试剂盒方法仍然十分缺乏，等待研发。今后，为实现更方便快捷、定性、定量、现场检测的要求，还应在将胶体金、酶联免疫、免疫层析等快速检测方法与现代分析技术相结合研究开发新型食品安全快速检测技术方面努力。

声明：本文所用图片、文字来源《广东化工》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除

相关链接：米酵菌酸，提取液，氨水